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逆向工程利器:拉曼光谱简介

日期: 2016-02-24
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摘要:拉曼光谱分析是基于拉曼散射这一现象而发展起来的近代分析技术。由于其具有高分辨率、不破坏样品、检测快速等优点,被广泛应用于晶型筛选、原料鉴定、活性成分定量测定、过程控制等药物分析领域。本文简单介绍了拉曼光谱分析的基本原理,以及其在药物分析领域的应用进展。


Abstract: Raman Spectra Analysis is a modern analyzing technology developed based on Raman scattering. The technology is widely used in the drug analysis field such as polymorph screening, identification of materials, content determination of active ingredients, in-process controls etc. due to its high-resolution, non-sample consumption and immediate detection and so on. The basic principle and usage of Raman Spectra was briefly introduced in the paper.

关键词: 拉曼光谱 药物分析

     早在1928年,C.V.拉曼在实验中发现,当光穿过透明介质被分子散射的光发生频率变化,这一现象称为拉曼散射,同年稍后在苏联和法国也被观察到。拉曼光谱(Raman Spectra),是一种散射光谱。拉曼光谱分析法是基于拉曼散射效应,对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息,并应用于分子结构研究的一种分析方法。由于其效应较弱,在很长一段时间内未被广泛应用。1960年以后,激光技术发展迅速,由于激光束具有高亮度、方向性和偏振性等特点,使其成为拉曼光谱的理想光源,给拉曼光谱的实际应用提供了现实可能性。

逆向工程利器:拉曼光谱简介

     拉曼光谱是一种基于拉曼散射原理的振动光谱。其仪器组成主要包括光源、样品装置、滤光系统、光波处理系统(单色器或干涉仪)和检测器等。拉曼光谱通常采用激光作为单色光源,将样品分子激发到某一虚态,而后受激分子跃迁到一个与基态不同的振动能级,此时,散射辐射的频率不同于入射频率,这种频率的变化与基态和终态的振动能级差相当,这种“非弹性散射”光即称为拉曼散射[1]。

逆向工程利器:拉曼光谱简介

拉曼光谱仪具有以下特点:具有共焦显微拉曼光学系统、0.8um的影像分辨率、Czerny-Turner对称式结构单色仪、实时非侵入与非破坏性检测、无须或极少准备样品、无消耗性化学废弃物、高分辨率、工作波数范围大,最低可探测波长可达538.9nm、可对样品表面进行um级的微区检测、可进行显微成像测量、快速检测以及操作简便。由于拉曼光谱的优点,其被广泛应用于化学,高分子材料学,生物学,宝石鉴定等众多领域。在药物分析中,拉曼光谱的主要用途在于如下几个方面[2]:a) 为晶型筛选提供技术支持(多晶型具有不同的溶解度,进而影响有效给药);b) 用于原料鉴定(建立广泛的拉曼光谱集);c) 不同处方中活性成分的定量测定;d) 为化学工艺放大提供支持。现主要就拉曼光谱在制药工业的应用作一简单概述。


1. 拉曼光谱在药物晶型鉴定中的应用

 众所周知,不同的药物晶型,具有不同的分子排布结构,进而影响药物的理化性质以及药理活性。美国食品药品监督管理局(FDA)。美国FDA要求多晶型药物在研制、生产、贮存过程中必须建立合适的分析方法鉴别晶型,甚至检查不同晶型的含量,保证其晶型的一致性。目前用于固体药物晶型检测的技术有熔点法、X-射线衍射法、热分析法、红外光谱法、固态核磁共振、拉曼光谱法等。叶晓霞等[3]认为X-射线粉末衍射是晶型检测的经典方法,但择优取向,制样重复性问题给定量应用带来一定的困扰。拉曼光谱和红外光谱同属于振动光谱,红外光谱源于分子的偶极矩的变化,拉曼光谱则源于分子极化率的变化。红外光谱难以测定低频区的振动,而拉曼光谱检测低频振动具有优越性,甚至可检测到分子的晶格振动。因此拉曼光谱在鉴别药物的多晶型方面具有独特的优势。拉曼光谱谱带的强度与待测物浓度的关系遵守比尔定律,可用于化合物定量分析。此外拉曼光谱无需特殊制样,可直接检测,避免了制样过程对晶型的影响。


叶晓霞建立的拉曼光谱法操作简便,可有效地检测拉米夫定原料中的晶型I含量。实验中,晶型I和晶型II的粉末分别装在玻璃瓶中,测定拉曼光谱,晶型I在696 cm-1、312 cm-1附近有明显的散射峰,晶型Ⅱ在916 cm-1,851 cm-1附近有明显的散射峰。拉米夫定的拉曼光谱中不仅出现与红外光谱中位移一致散射峰,还出现了红外光谱无法检测的低波数特征峰。拉曼光谱图中,晶型I在696 cm-1有明显的、独立的散射峰,而晶型Ⅱ在696 cm-1没有明显的散射峰。696 cm-1散射峰强度呈现明显的浓度依赖性,故选择696 cm-1的散射峰为定量峰,537 cm-1散射峰作为内标峰。采用定量峰和内标峰的强度比值(I696/I537)进行定量计算。另外在实验中进行了线性关系、精密度、检测线和定量限的确定。在实验中,选择合适的曝光时间和采样次数,可以有效地减少荧光干扰。通过优化建立了可以有效监测拉米夫定原料中晶型I含量的方法。

逆向工程利器:拉曼光谱简介


2. 药物分子化学结构鉴定

拉曼光谱属于振动光谱,可以与红外光谱相互补充,提供更为全面、准确的分子振动状态和分子结构等方面的信息。王吉有等[4]测量并分析了盐酸苯海拉明的红外光谱和拉曼光谱,结合分子振动理论,对拉曼光谱图中特征峰进行了归属,可有效确证盐酸苯海拉明的结构。

    邹乔等[5]选用B3LYP/6-31G(d)优化并计算了31种饱和一元醇类分子的拉曼光谱,以甲醇为例,考察了理论计算结果的准确性,分析了碳原子数小于7的直链饱和一元醇拉曼光谱振动峰的归属。研究结果显示,B3LYP/6-31G(d)用于饱和一元醇类分子拉曼光谱振动的模拟计算较为准确,通过饱和一元醇拉曼光谱振动峰归属分析,确认C-O伸缩振动引起的振动峰可作为饱和一元醇类分子拉曼光谱的特征峰;进一步研究还发现,饱和一元醇类分子拉曼光谱的特征峰与其极化率、热力学、能量等主要参数具有显著的相关性(Sig.为0.015),为同系物的拉曼光谱研究提供了参考价值。


3. 药物处方分析

拉曼光谱有个重要的优点是能对固体进行直接检测。Breitenbach等[6]应用共轭聚焦拉曼光谱研究解热镇痛药布洛芬的固体分散体,该实验小组研究了在降解条件下(从-90℃到90℃)处方理化性质的稳定性,并研究了药物骨架中药物的含量以及均一性。结果表明共轭聚焦拉曼光谱可以用于检测固体分散体系中的空间分布,并对可能发生的变化进行监控,例如重结晶过程。根据Breitenbach小组的研究成果,共轭聚焦拉曼光谱可以研究不同的药物层面(如片剂包衣层),表面(相分离)或者混合程度,这些对于制药工业具有重要意义。


4. 在药品生产工艺过程分析中的应用

药品生产工艺过程中的质量控制可以用以保证产品质量。拉曼光谱作为一项新的过程控制技术,由于其检测迅速,可以详细产生特定光谱而不破坏样品,从而被越来越多的应用于在线控制。Urvi Gala等详尽的总结了拉曼光谱在片剂生产过程中的应用[7]:


5. 检测生物大分子损伤

     由于拉曼光谱技术与常规化学分析技术相比,具有对样品无损、样品制备简单和所需样品量少等特点,广泛用于生物大分子结构变化的研究。拉曼光谱不仅可以用于蛋白质、核酸和脂类等生物大分子损伤的快速检测,而且可以用于癌症的诊断与手术治疗。通过对比正常组织与癌变组织的拉曼光谱,可以找到两种组织特征吸收峰的差异,从而为癌症的最终确诊和确定肿瘤切除范围提供重要信息。

Huang等[8]研究了肺癌与正常支气管组织的拉曼光谱,结果表明,与正常组织相比,肿瘤组织拉曼光谱中的核酸、色氨酸和苯丙氨酸的含量偏高,而磷脂、脯氨酸和缬氨酸的含量偏低;正常组织和肿瘤组织在1000~1100、1200~1400和1500~1700cm-1三个区域内的拉曼光谱差异显著,峰强比I1445/I1655可作为正常组织与癌变组织的辨别标准。黄鹰等利用激光拉曼光谱技术对胃癌细胞及正常胃细胞进行快速检测,发现了胃癌组织在特定波长583、633和656nm处出现特征拉曼峰,且峰强随着癌细胞浓度的增加而升高。

Benevides等[9]利用激光拉曼光谱对三种药物(溴化乙锭,双氨吖啶,9-氨基吖啶)在DNA上的结合位点及 DNA分子结构的变化情况进行了研究,结果表明溴化乙锭主要作用于胸腺嘧啶,双氨吖啶和9-氨基吖啶主要作用于鸟嘌呤;在溴化乙锭和双氨吖啶的作用下,DNA由B构型转变为A-构型,而9-氨基吖啶使部分DNA发生解螺旋现象,但未改变其构型。


6. 中药材真伪鉴别

拉曼光谱技术凭借其样品制备简便、对水的散射小等优点,拉曼光谱成功鉴别出了单味中医药的成分、产地以及真伪。 同时,表面增强拉曼光谱技术在中医药煎剂成分的鉴定中也体现出了其优越性。

周群等[10]采用傅里叶变换拉曼光谱法对12个来自不同产地、不同种植方式及不同采集时间的中药材黄芩进行了研究分析,结果表明采用拉曼光谱特征峰的频率和强度鉴别不同种植方式的黄芩样品较传统方法更直接、快速,且不破坏样品,更为准确科学。

林文硕等[11]采用近红外拉曼光谱对山药成分进行分析。并在山药的拉曼光谱的基础上,获得山药拉曼一阶导数谱。拉曼谱中出现的 477cm-1,863cm-1,936cm-1强峰,可认为是山药的特征峰。对山药的拉曼光谱进行分析,其拉曼谱峰主要归属酰胺类、氨基酸类、蛋白质类、碳水化合物类拉曼光谱的特征,可以粗略判定山药中含有蛋白质、氨基酸、淀粉、多糖等物质,这与已有的山药化学成分研究结果相符。 而在山药拉曼一阶导数谱中 467cm-1、870cm-1、 943cm-1、1085cm-1等处均出现了较明显的特征峰。对比山药拉曼光谱,在600cm-1~800cm-1,1000cm-1~ 1400cm-1区域内,山药拉曼一阶导数谱可以更为清晰的表现山药拉曼光谱。

目前,拉曼光谱已成功鉴别了中医药的成分、产地、栽培技术以及真伪。这使得拉曼光谱技术及其表面增强拉曼光谱技术在复方中医药的质量、稳定性、有效成分分析方面有着广阔的发展前景。


7. 生物制品检测

人血白蛋白是从健康人的血液中提取的,可直接静脉注射到病人体内的急救特效药,主要用于失血创伤、烧伤引起的休克,脑水肿及损伤引起的颅压升高,肝硬化及肾病引起的水肿或腹水等方面的治疗。对于人血白蛋白的检测,一些行之有效的检验方法得到了应用,如比色法、紫外法、剂盒法、旋光法、高效液相色谱等。

王玉等[12]建立了快速鉴别人血白蛋白的拉曼光谱法,采集不同产家不同批次人血白蛋白的拉曼光谱图,建立人血白蛋白的特征拉曼光谱图,将采集的样品拉曼光谱图与特征拉曼光谱图进行比对分析,结合拉曼光谱峰位移频率和峰强度的相似度计算结果,以判断人血白蛋白样品的真假伪劣。人血白蛋白在 3407cm-1处出现的宽而强的谱带是 OH、NH 伸缩振动峰,3071cm-1和 2934cm-1的峰可归属于 CH3、CH2的对称和不对称伸缩振动,1656cm-1和 1615cm-1的峰应属于 C =O 的伸缩振动,可能是酰胺I带,1452cm-1的峰归属于 CH 的变形振动,也可能含有环的伸缩振动;1343cm-1的峰可归属于 C-N 伸缩振动( 也可直接归属为酰胺III带) ,1208cm-1和 1106cm-1的 2 个弱峰可归属于 CO 和 CN 伸缩振动组合,1004cm-1处中等强度的峰应是典型的环伸缩振动,942cm-1和 897cm-1处及其他一些更弱峰可归属于环上 CH 或 CH2的变形振动,752cm-1、644cm-1、563cm-1处以及其他一些更弱峰也可CN 伸缩和 CH 变形振动。这些峰,特别是中等强度以上的峰组合构成人血白蛋白的特征拉曼光谱,可作为样品是人血白蛋白判断依据。假人血白蛋白则没有对应上述峰。

总结

    拉曼光谱由于其独特的优点,越来越多的被应用于药物化学,药剂学以及生药学的研发、生产以及质量控制等众多领域。由于其独特性,高效性和便捷性,将有着更加广阔的应用前景。



参考文献:


[1] 张琳,曹晓云等.拉曼光谱技术及其在药物分析中的应用[J].天津药学,2014,26(4): 46-49.

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[4] 王吉有,郭姣,邹兆贵等.苯海拉明的拉曼光谱和红外光谱研究[J].光散射学报,2012, 24(4): 371.

[5] 邹乔,杜显元,张琛等.饱和一元醇类分子拉曼光谱振动峰的归属研究[J].光谱学与光谱分析, 2013, 33(1): 106-110.

[6] Breitenbach J, Schrof W, Neumann J. Confocal Raman-spectroscopy: analytical approach to solid dispersions and mapping of drugs. Pharm Res. 1999,16: 1109–1113.

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[9] James M. Benevides, Jessica Kawakami andGeorge J. Thomas Jr. Mechanisms of drug-DNA recognition distinguished by Raman spectroscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 2008, 39(11): 1627.

[10] 周群,蔡少青,王建华等.拉曼光谱法快速鉴别黄芩中药材[J].光散射学报,2002, 14(3): 166.

[11] 林文硕,陈荣,李永增等.山药近红外拉曼光谱分析[J].光谱学与光谱分析, 2008, 28(5): 1095-1097.

[12] 王玉,王思寰,陈建国等.拉曼光谱法快速鉴别人血白蛋白[J].药物分析杂志, 2012, 32(3): 537-540.




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